Stato di metilazione di HLA-G, infezione da HPV e neoplasie cervicali: studio caso-controllo condotto su una popolazione brasiliana

HLA-G promoter methylation status, HPV infection and cervical neoplasia: a Brazilian case-control study

OBIETTIVI GENERALI E SINTESI PROGETTO

Obiettivo principale: valutazione del ruolo delle modificazioni epigenetiche (de-metilazione del promotore) e genetiche (polimorfismi) di HLA-G sullo sviluppo di lesioni neoplastiche cervicali.

La correlazione diretta tra il tumore della cervice uterina e la persistenza dell’infezione da papillomavirus umano (HPV) è riconosciuta, ma il meccanismo che favorisce la persistenza virale nelle cellule cervicali è ancora ignoto. Tra le numerose ipotesi, si annovera la maggiore o minore predisposizione del sistema immunitario nel controllo e nella risoluzione di questo tipo di infezione.

Alcune evidenze scientifiche hanno mostrato il possibile coinvolgimento di una proteina implicata nella soppressione della risposta immunitaria, l’HLA-G, e in particolare nell’immunoescape del tumore dal sistema immunitario.
Per valutare il ruolo delle modificazioni genetiche ed epigenetiche di HLA-G sullo sviluppo di lesioni neoplastiche cervicali si è allestito uno studio caso-controllo in cui confrontare lo stato di HLA-G in soggetti con cellule cervicali atipiche (lesioni CIN II - CIN III) rispetto a soggetti con cellule citologicamente normali, in relazione con lo stato di infezione da HPV.

Possibile estensione all'analisi di metilazione di altri geni umani e di geni virali relativi ai soggetti con infezione da ceppi 16, 18, 31 e 45.

MATERIALI, METODI E RISULTATI ATTESI

Collaborazione Unità di Epidemiologia dei Tumori dell’Università degli Studi di Torino e Lab of Immunogenetics and Histocompatibility (LIGH), Federal University of Paranà, Curitiba, Brasile. Studio caso-controllo che coinvolge 789 donne (15- 47 anni) afferenti a tre centri di riferimento per le analisi citologiche cervico-vaginali di Curitiba.
Non essendo localmente attivi programmi organizzati per lo screening del tumore cervicale, la popolazione presenta prevalenza di lesioni cervicali di alto grado più elevata rispetto a quella italiana.
Controlli: 510 donne con esito cito/istologico normale. Casi: 279 donne con esito istologico CIN2 (150) o CIN3 (129). A tutte le donne è stato proposto un questionario per raccogliere informazioni anamnestiche riguardanti dati demografici (età, gruppo etnico, livello d’istruzione) e abitudini di vita (attività sessuale, numero di gravidanze, esposizione al fumo).
A tutte le donne è stato chiesto di donare un campione di cellule cervicali e un campione di sangue; il campione cervicale da utilizzare per le analisi dello stato di infezione da HPV e di metilazione di HLA-G; il campione di sangue viene utilizzato per le analisi dei polimorfismi di HLA-G.
Metodi analitici per lo stato di infezione da HPV: PCR con primer GP5+/GP6+; genotipizzazione con multiplex PCR.
Metodi analitici per lo stato di metilazione del gene HLA-G: pirosequenziamento. Metodi analitici per analisi delle varianti alleliche di HLA-G: PCR con sonde specifiche per la sequenza analizzata (SSOP, sequence specific oligonuclotide probes-PCR) e tecnologia Luminex.

Lo studio darà informazioni sul possibile coinvolgimento di HLA-G nello sviluppo di neoplasie cervicali: l'eventuale presenza di de-metilazione del promotore di HLA-G o di particolari polimorfismi di HLA-G nei casi rispetto ai controlli potrebbe indicare una maggiore predisposizione alla persistenza virale e allo sviluppo di lesioni.

STATO DI AVANZAMENTO AL 31/12/2017

Sono ad oggi conclusi i seguenti processi.

  • Reclutamento della popolazione in studio (15-47) in Curitiba (Brasile): 279 casi (CIN II e CIN III) e 510 controlli (citologia normale): 2011.
  • Allestimento del database che raccoglie tutte le informazioni demografiche, anamnestiche e riguardanti stili di vita e abitudini sessuali ottenute dai questionari: 2011.
  • Archivio del DNA estratto dai campioni cervicali e di sangue ottenuti dalle donne partecipanti: 2011.
  • Screening per la presenza di HPV nei campioni cervicali e genotipizzazione dei campioni positivi: 2011.
  • Analisi dello stato di metilazione del promotore di HLA-G su un sottogruppo di 76 controlli e 96 casi: 2012.
  • Pubblicazione del manoscritto che incorpora i risultati: 2012.
  • Analisi della metilazione del promotore di ulteriori 4 geni umani (CADM1, MAL, DAPK1, RARb): 2016.

Si sono svolte, in particolare, nel corso del 2017, sia analisi della metilazione dei geni virali di ceppi selezionati (16, 18, 31, 45) sia analisi statistiche della metilazione dei geni umani e virali.

RISORSE E FINANZIAMENTI

Compagnia di San Paolo / FIRMS; Ministero della Salute.

COLLABORATORI

Lorenzo Richiardi, Laura De Marco, Valentina Fiano, Morena Trevisan, Anna Gillio-Tos, Carlotta Sacerdote.

PUBBLICAZIONI

- Gillio-Tos A, Bicalho Mda G, Fiano V, et al. Case-control study of HLA-G promoter methylation status, HPV infection and cervical neoplasia in Curitiba, Brazil: a pilot analysis. BMC Cancer 2012; 12: 61 8. (IF 3.01)
- Valentina Fiano, Morena Trevisan, Francesca Fasanelli, et al. Methylation in host and viral genes as marker of aggressiveness in cervical lesions: a cross sectional analysis in 543 unscreened women. Submitted Cancer Research