Frequenza e infettività di HCV-RNA nei linfociti di soggetti con patologie non correlate a HCV

HCV-RNA frequency and infectivity in perypheral blood lymphocytes of subjects free of HCV related pathologies

OBIETTIVI GENERALI E SINTESI PROGETTO

Recentemente è stata descritta una nuova patologia definita “infezione occulta da virus dell’epatite C” (HCV occulta), con HCV-RNA nei linfociti periferici e nelle cellule epatiche, e assenza di anticorpi contro il virus e di RNA virale nel siero. Nei linfociti del sangue periferico dei pazienti con infezione occulta da HCV è stata descritta replicazione di HCV. Sebbene questi pazienti non siano sierologicamente positivi al virus, potrebbero essere potenzialmente infettivi.

Studi preliminari condotti presso il Laboratorio di Epidemiologia Molecolare del CeRMS di Torino hanno evidenziato su un campione di 276 soggetti italiani sani, negativi per sierologia e viremia, una frequenza pari circa al 3% di HCV-RNA nei linfociti. Tale condizione è riconducibile al quadro descritto come “infezione da HCV occulta”.

Nonostante HCV sia ormai riconosciuto come agente causale del tumore del fegato, al momento i meccanismi della carcinogenesi virale non sono noti. Studi sulla frequenza di HCV occulta e sulla potenziale infettività virale di linfociti positivi a HCV-RNA potranno fornire indizi rilevanti sui meccanismi patogenetici e sull’opportunità di avviare successivi studi su più ampia scala volti a stimare il rischio di cancerogenesi epatica.

Obiettivi del progetto:

  • selezionare soggetti con HCV occulta all’interno di una popolazione priva di patologie epatiche clinicamente evidenziabili o di patologie HCV correlate;
  • valutare l'infettività virale di HCV in pazienti con HCV occulta, cioè valutare il potere infettivo di linfociti positivi a HCV-RNA;
  • valutare nei linfociti di questi soggetti la presenza di uno o più genotipi HCV prevalenti;
  • valutare presenza di HCV occulta nei soggetti con epatiti croniche criptogeniche in collaborazione con la SC Gastroenterologia dell'AOU Città della Salute e della Scienza di Torino.

MATERIALI, METODI E RISULTATI ATTESI

Collaborazione con la Banca del Sangue dell’AOU Città della Salute e della Scienza di Torino, selezione tra i pazienti afferenti per flebotomia (salasso) di 400 soggetti con patologie non correlate a infezione da HCV (policitemia vera, emocromatosi, emosiderosi secondaria, poliglobulia secondaria).

Criteri di inclusione: negatività alla ricerca sierologica per HCV, HBV e HIV e per la presenza di HCV-RNA nel plasma. In qualità di controlli positivi, circa 50 soggetti afferenti alla Banca del Sangue positivi al virus HCV.
Metodi analisi molecolare: estrazione di RNA linfociti e plasma e retrotrascrizione a cDNA. Rilevazione di HCV-RNA nella frazione leucocitaria mediante kit commerciale (Alfa Wasserman) per l’amplificazione in nested-PCR della regione 5’UTR di HCV. Genotipizzazione mediante kit commerciali Line Probe Assay e/o sequenziamento diretto della regione UTR 5’ terminale. Per lo studio sulla potenziale infettività virale è stata avviata una collaborazione con laboratori di biologia cellulare, utilizzando linfociti vitali archiviati e conservati in azoto liquido sino al momento dell’uso.

Attualmente in fase di reclutamento: soggetti con epatiti croniche criptogeniche in collaborazione con la SC Gastroenterologia dell'AOU Città della Salute e della Scienza di Torino.

STATO DI AVANZAMENTO AL 31/12/2017

Sono stati conclusi i seguenti processi:

  • selezione e reclutamento dei soggetti presso la Banca del Sangue: i 450 soggetti consecutivi tra pazienti con policitemia vera, poliglobulia secondaria, emocromatosi, emosiderosi secondaria e 50 come popolazione di controllo con patologie HCV correlate (positività confermata ai test anti-HCV e/o HCV-RNA);
  • è stato allestito un database elettronico con codici identificativi dei soggetti e informazioni relative all’archivio dei campioni in studio e ai risultati dell'analisi sierologiche e molecolari;
  • prelievo da ogni paziente di 4 provette in EDTA per la ricerca di HCV-RNA nei linfociti e nel plasma e per la ricerca di anti-HCV, HBsAg, anti-HIV1-2;
  • su tutti i casi HCV-RNA positivi nel plasma e/o nel buffy-coat è stata eseguita la genotipizzazione;
  • su tutti i soggetti in studio è stato effettuato il dosaggio delle transaminasi seriche;
  • sui soggetti HCV-RNA positivi nel buffy-coat è stata eseguita l'analisi della potenziale infettività virale;
  • pubblicazione di un manoscritto con i risultati;
  • follow-up dei pazienti risultati positivi alla presenza HCV-RNA solo nel buffy-coat per valutare clearance o persistenza del virus.

RISORSE E FINANZIAMENTI

Compagnia di San Paolo / FIRMS, Ricerca Sanitaria Finalizzata.

COLLABORATORI

Laura Da Marco, Anna Gillio-Tos, Valentina Fiano, Lorenzo Richiardi, Rinaldo Pellicano.

PUBBLICAZIONI

- De Marco L, Manzini P, Trevisan M, et al. Prevalence and follow-up of occult HCV infection in an Italian population free of clinically detectable infectious liver disease. PLoS One 2012; 7: e43541.
- De Marco L, Gillio-Tos A, Fiano V, et al. Occult HCV infection: an unexpected finding in a population unselected for hepatic disease. PLoS One 2009; 4: e8128.