Rilevamento dello stato di integrazione di papillomavirus di ceppo 16 in lesioni cervicali pre-neoplastiche confermato con DIPS-PCR e sequenziamento

Detection of human papillomavirus type 16 integration in pre-neoplastic cervical lesions and confirmation by DIPS-PCR and sequencing

OBIETTIVI GENERALI E SINTESI PROGETTO

  • Analizzare lo stato fisico dell’infezione da papillomavirus di ceppo 16 (HPV16) in lesioni cervicali pre-neoplastiche, utilizzando un metodo di analisi quantitativa in real time-PCR (QRT-PCR) delle sequenze virali integrate.
  • Allestire uno studio preliminare per valutare l’affidabilità di tale metodo nell’identificazione di sequenze di HPV16 integrate nel genoma della cellula ospite attraverso la conferma dei risultati con un metodo “gold standard” rappresentato dalla DIPS-PCR (Detection of Integrated Papillomavirus Sequences) seguita da sequenziamento.
  • Utilizzare il metodo in QRT-PCR per analizzare un’ampia casistica di lesioni cervicali pre-neoplastiche raccolta nel corso dello Studio NTCC (P.I. Guglielmo Ronco).
  • Valutare il ruolo dell’identificazione precoce dello stato di integrazione virale per l’identificazione e il monitoraggio di soggetti a più alto rischio di progressione neoplastica.

MATERIALI, METODI E RISULTATI ATTESI

Per lo studio preliminare sono stati selezionati 170 campioni d’archivio di cellule cervicali ottenuti da donne coinvolte in programmi di screening per il carcinoma della cervice uterina organizzati a Torino tra il 1996 e il 2002.

Tutti i 170 campioni risultavano positivi a ceppi di HPV ad alto rischio di carcinogenesi, e sono stati testati per la presenza di HPV16 DNA. Nei campioni risultati positivi per HPV16 DNA è stata valutata la presenza di sequenze virali integrate nel genoma delle cellule ospiti mediante QRT-PCR. I risultati sono stati confermati con DIPS-PCR e successivo sequenziamento.

SCALA DEI TEMPI

  • 2014: completamento delle analisi statistiche sui dati da NTCC. Stesura del manoscritto.
  • 2015: analisi dei risultati sul carico virale relativamente alle infezioni HPV con ceppo 16 e 18 in associazione ai risultati dello stato di metilazione virale.

STATO DI AVANZAMENTO AL 31/12/2015

Lo studio preliminare è stato concluso e i risultati che dimostrano l’affidabilità del metodo di indagine e ne validano l’impiego in studi su vasta scala sono stati raccolti in un manoscritto pubblicato su J. Clin Virol nell’anno 2007. E’ in corso l’analisi sulla casistica di campioni cervicali HPV 16 e HPV 18 positivi raccolti nel corso dello Studio NTCC (P.I. Guglielmo Ronco).

Sono stati conclusi i seguenti processi.

  1. Raccolta dei campioni e allestimento di una banca biologica di campioni di cellule cervicali positivi a ceppi di HPV ad alto rischio con diagnosi istologica definita raccolti nell’ambito dello studio NTCC (P.I. G. Ronco) in seguito a screening con test molecolare Hybrid Capture 2.
  2. Estrazione di DNA dai campioni positivi ad HPV ad alto rischio.
  3. Genotipizzazione dei ceppi virali.
  4. Messa a punto delle metodiche per l’analisi in QRT-PCR del carico virale e dello stato di infezione (episomale o integrato) non solo di HPV16 ma con estensione ad altri genotipi virali: HPV18 e HPV 31.
  5. Messa a punto di una metodica con impiego di Sybr Green come intercalante del DNA per analizzare in QRT-PCR il carico virale di tutti gli altri ceppi ad alto rischio identificabili con i primers GP5+/6+.
  6. Analisi in QRT-PCR dello stato di infezione (episomale o integrato) da HPV 16 e HPV 18 nei campioni dello studio NTCC.

Sono in corso i seguenti processi:

  • analisi statistiche dei risultati dello stato di infezione da HPV 16 e HPV 18 nei campioni NTCC in relazione al grado delle lesioni cervicali istologicamente confermate;
  • previsione di utilizzo dei risultati in associazione dello stato di metilazione virale in corso di analisi.

RISORSE E FINANZIAMENTI

Il progetto è co-finanziato dalla Compagnia di San Paolo / FIRMS, CIPE, MIUR, AIRC.

COLLABORATORI

Guglielmo Ronco, Laura De Marco, Anna Gillio-Tos, Valentina Fiano.

PUBBLICAZIONI

- De Marco L, Gillio-Tos A, Bonello L, Ghisetti V, Ronco G, Merletti F. Detection of human papillomavirus type 16 integration in pre-neoplastic cervical lesions and confirmation by DIPS-PCR and sequencing. J Clin Virol 2007; 38: 7-13.
- de Araujo MR, De Marco L, Santos CF, Rubira-Bullen IR, Ronco G, Pennini I, Vizzini L, Merletti F, Gillio-Tos A. Screening and quantification of Human Papillomavirus by GP5+/6+ and SYBR Green methodology. J Clin Virol 2009; 45: 90-5.